甘油保菌总翻车？资深实验员的「冻存 - 复苏」绝招大公开！
发布时间：2025-09-09 浏览次数：267
甘油保菌：简单操作背后的大学问
一）甘油护菌的原理
甘油是实验室常用的试剂，它在微生物冻存中发挥着重要作用。从物理性质来看，甘油是多羟基醇，能与水分子通过氢键紧密结合，加入菌液后，溶液冰点显著降低，减少了冷冻时冰晶的形成。冰晶对细胞危害极大，容易刺破细胞膜、细胞壁，破坏细胞器和DNA，导致细胞死亡。
甘油不仅能作用于细胞外，还能穿透细胞膜进入细胞内部。冷冻时，细胞外水分先冻结，形成高渗透压，若无保护，细胞内水分会被抽出，导致细胞皱缩甚至死亡；复温时，外部冰融化，渗透压骤降，水分快速涌入细胞，可能使细胞膜破裂，这就是“渗透性休克”。甘油作为可渗透性保护剂，能平衡细胞内外渗透压，减少细胞脱水程度和速度，让细胞在冷冻 - 解冻过程中的体积变化更缓和。
甘油还能与蛋白质、核酸、磷脂等生物大分子相互作用，稳定其三维结构，防止变性、沉淀或聚集；同时，它可插入细胞膜的脂质双分子层，维持细胞膜在低温下的流动性，保持膜结构完整性。
不过，甘油使用浓度很关键，一般终浓度需控制在15% - 25%。浓度太低，保护效果差；浓度过高，会因渗透压过大或毒性损伤细胞。不同微生物对甘油耐受性有差异，实际操作中需针对菌种优化。
二）冻存的核心目的
在科研实验中，冻存菌种并非简单将菌液低温保存，而是要“锁死菌的状态”。
微生物菌种在传代培养过程中，极易出现各种状况。它们可能会被杂菌污染，打乱实验计划；也可能发生变异，失去生物学特性，让科研人员的努力付诸东流；甚至还可能死亡，导致菌种资源流失。
甘油冻存能让菌种在低温下进入“休眠状态”，维持“不死、不变、不退化”。冻存前对菌液的选择至关重要，对数生长期的菌液是最佳选择，此时菌体代谢活跃，细胞膜完整，生理状态良好，抗冻能力强，最适合冻存。若选用衰亡期菌液，菌体代谢缓慢，细胞结构可能受损，存活率低，后续复苏也会面临问题。
保菌总翻车？先揪出这3个“罪魁祸首”
甘油保菌看着简单，其实操作起来很容易出错。我见过不少实验，就因为一些小细节没注意，结果全盘皆输。下面，咱们就来扒一扒那些导致甘油保菌失败的“罪魁祸首”。
一）“浓度陷阱”：甘油不是越多越好
新手最容易犯的错误，就是甘油浓度配错了。我见过有实验室，稀里糊涂地把50%的甘油当成了终浓度来用，结果复苏的时候发现菌体全脱水皱缩了。为啥？因为渗透压太高了，细菌就像被晒干的海绵一样，根本没办法复活。正确做法是：先配好50%的甘油母液，灭菌之后，再跟等体积的菌液混在一起，这样终浓度就能稳定在20%-25%。这个浓度刚刚好，既能起到保护作用，又不会让菌体因为渗透压过高而“中毒”。
二）“操作马虎”：无菌意识薄弱是大忌
冻存的时候随手拿个没灭菌的枪头，复苏的时候在超净台外面打开冻存管——这些看似没啥大不了的操作，其实就是在给杂菌“开绿灯”。我有个同行，一直抱怨菌种复苏后长出了杂菌，后来一查才发现，原来是冻存的时候用了没烘干的离心管，残留的水分里有细菌。所以，从配培养基到分装冻存，每一步都得严格无菌操作。超净台提前30分钟紫外灭菌，手和试剂瓶都得用75%的酒精擦一擦。别因为一时的“粗心”，毁了整个实验。
三）“温度失控”：反复冻融是菌体“杀手”
冻存管在-20℃和-80℃冰箱之间来回折腾，或者复苏之后没及时用完又重新冻回去——这些操作对菌体来说简直就是“酷刑”。每次冻融，都会形成尖锐的冰晶，就像小刀一样划破细胞膜，菌体大量死亡。数据也显示，反复冻融3次以上，菌体的存活率会一下子降到30%以下。所以冻存的时候一定要分装小剂量，每管0.5-1ml，每次复苏只用一管，用完就完，别再冻回去。
冻存“黄金法则”：资深实验员私藏技巧
一）冻存前：挑对菌、配好液、分好装
选菌标准：只选处于对数生长期的菌体，这时候菌体活力最佳，各项生理指标都处于巅峰状态。具体操作是将菌体接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养，直到菌液浑浊但未变黏稠（OD600约0.6 - 0.8）。如果培养过头进入稳定期，菌体的抗冻能力会大幅减弱。
配液公式：按照1:1的比例，取50%灭菌甘油溶液与等体积菌液混合。例如，500μl菌液加500μl甘油，摇匀后分装到1.5ml灭菌离心管，每管不超过1ml。混匀时不要用暴力涡旋，轻柔吹打10次即可，避免产生气泡。气泡在冻存时可能会结冰膨胀，挤破菌体。
冻存姿势：“速冻”才是王道。不要把离心管直接扔进-80℃冰箱。正确做法是先放入-20℃预冻1小时，让菌体适应低温环境，再转移到-80℃长期保存。有条件的实验室可以用程序降温盒（每分钟降温1℃），模拟“缓冻”过程，进一步提升存活率。
二）冻存后：做好记录，定期“体检”
冻存管上要用耐低温记号笔标注菌种名称、日期、甘油浓度和操作者，最好再建个电子台账，记录每管的冻存位置。曾经有实验室因为没有记录，在-80℃冰箱里翻找了3小时，导致其他冻存管反复升温受损。此外，每隔6个月要复苏一管做“活力检测”，通过平板划线观察菌落形态，或做生化鉴定，确保菌种没变异、没污染。
复苏“反套路”：快解冻、慢活化，别踩“心急”坑
一）解冻：37℃水浴，1分钟内唤醒菌体
从-80℃冰箱里拿出冻存管，这就像是在唤醒一个睡了很久的菌。这个过程必须小心谨慎。正确的操作是把冻存管立刻放到37℃的水浴里，同时用手轻轻晃动。这样能让冻存管里的冰块在1分钟内完全融化。记住，一定要用“水浴”，不能在室温下慢慢解冻。之前有个实验员为了省事，把冻存管放在桌上自然解冻，结果20分钟后冰块才完全融化，菌体的存活率已经降到50%。解冻完成后，要迅速用酒精消毒管口，然后在超净台内打开，整个过程千万不能让管口接触任何东西，以免引入杂菌。
二）活化：两次培养，确保菌体“满血复活”
① 首次活化：给菌体“喝营养液”
刚解冻的菌体就像刚睡醒的人，迷迷糊糊、浑身乏力，急需补充营养。这时候要用灭菌接种环挑取少量冻存菌，接入3ml LB液体培养基中，然后在37℃、150rpm的条件下振荡培养过夜。这一步就像是给刚睡醒的菌体端上一杯“营养液”，让它们慢慢适应环境，恢复一些体力。但别指望一次活化就能让菌体达到最佳状态，直接拿去做实验。很多新手都容易犯这个错误，直接拿首次活化的菌做实验，结果发现菌体长势很差。这是因为首次活化后的菌体还没有完全恢复元气。
② 二次活化：让菌体“彻底清醒”
首次活化只是让菌体初步恢复，想要让它们“彻底清醒”，发挥出最佳性能，还需要进行二次活化。具体操作是将首次活化的菌液按1:100的比例接种到新的LB培养基中，同样在37℃、150rpm的条件下培养4 - 6小时。经过两次活化的菌体，代谢活性达到了峰值。无论是用它们来做质粒提取还是蛋白表达，实验效果都会更稳定。所以，千万别嫌这一步麻烦，它可是避免实验结果“忽好忽坏”的关键。
三）避坑：这些操作等于“谋杀菌体”
在菌种复苏的过程中，有些操作就像是给菌体“挖坑”。比如，解冻后绝对不能把剩余菌液倒回冻存管。哪怕菌液只在室温下暴露30秒，再冻回去也会导致大量菌体死亡。活化时也不能用选择性培养基，像加了抗生素的LB培养基就不行。刚复苏的菌体太脆弱了，很容易就会被“药死”。另外，复苏后的菌液要在24小时内使用，如果超过48小时，可能会因为甘油残留影响菌体的生长。
特殊菌种“特殊照顾”：别用一套方案走天下
微生物世界丰富多样，不同菌种有着独特的生存习性。在甘油保菌过程中，若想让所有菌种都住得舒心、活得长久，就得学会“因材施教”，根据它们的特点提供个性化的“照顾”。
一）真菌：孢子悬液 + 20%甘油更适配
霉菌、酵母菌等真菌，在保藏时需要特殊呵护。建议先用无菌生理盐水制备孢子悬液，再与等体积20%甘油混合。真菌细胞较大，直接用菌液冻存，在冷冻过程中极易因机械损伤而死亡；而孢子结构更坚韧，配合甘油，能在低温环境中长期保存。
等到复苏时，要将其接种到固体PDA培养基上，然后放在28℃的环境中培养2 - 3天。相较于液体培养基，固体PDA培养基更易观察菌落形态，能帮助我们及时了解真菌的生长状况。
二）厌氧菌：冻存时“隔绝空气”是关键
像破伤风梭菌这类厌氧菌，对空气非常敏感。在冻存时，除了加甘油，还要在离心管内充入氮气排出空气，或者使用专门的厌氧冻存管，让它们在里面安心休眠。
复苏时也不能掉以轻心，千万别让它们在空气中暴露太久。接种时，要把它们接到含巯基乙酸钠的厌氧培养基中，再将温度控制在37℃，培养48小时。只有确保无氧环境，才能成功激活菌体。
三）芽孢杆菌：先“诱导芽孢”再冻存
芽孢杆菌在对数生长期主要以营养体存在，此时冻存存活率低。建议在培养后期（稳定期）加入0.1% MnSO4诱导芽孢形成。这个时期的菌体形成了抗性极强的芽孢，再与25%甘油混合冻存，保藏时间可延长至5年以上。
复苏时就轻松多了，无需特殊处理，正常活化即可。
本文来源于网络，版权归原作者所有，仅供学习参考，如有侵权请联系删除！
